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饲料中黄曲霉毒素B1检测方法
文章作者:detie 上传更新:2015-11-7 11:48:52


一、使用单位需自备的设备及试剂

1)仪器

微孔板酶标仪(450 nm/630 nm)

氮气吹干装置

振荡器

离心机

涡旋仪

粉碎机

电子天平(感量0.01 g

2)器材

单道微量移液器:20 μL200 μL100 μL~1000 μL

多道微量移液器:30 μL300 μL

3)试剂

黄曲霉毒素B1试剂盒。

二、溶液的配制

样本前处理需配制:

配液1:样品稀释液:将浓缩样品稀释液用去离子水按1:9 体积比进行稀释(1 份浓缩样品稀释液+9 份去离子水)。

配液2:洗涤工作液:将浓缩洗涤液用去离子水按1:9 体积比进行稀释(1 份浓缩洗涤液+9 份去离子水)。

配液3:样品提取液:用去离子水将甲醇按3 : 2 体积比进行稀释(3 份甲醇+2 份去离子水)用于提取样本中的黄曲霉毒素。

、样本前处理方法

样本处理前须知:

处理任何样本时,都须注意:

1)实验中必须使用一次性吸头,在吸取不同的试剂时要更换吸头。

2)实验之前须检查各种实验器具是否干净,必须使用洁净实验器具,以避免污染干扰实验结果。

样本前处理步骤:

A)谷物(大米、玉米、小米等低脂含量)及配合饲料

1. 5 g 粉碎样品,加入25 mL 样品提取液;

2. 充分振荡混匀5-10 min

3. 4000 r/min 离心5 min,或用定量分析滤纸过滤;

4. 0.2 mL 离心后的上清液或过滤后的滤液加入到1 mL

品稀释液中进行稀释并充分混匀;

5. 50 μL 稀释后的样品待测。

稀释倍数:30

B)花生、花生饼等油脂高的饲料

1. 5 g 粉碎的样品,加入20 mL 石油醚或正己烷和25 mL样品提取液;

2. 充分振荡混匀5-10 min

3. 离心或静置分层后去除上层液体;

4. 0.2 mL 下层液体加入到1 mL 样品稀释液中进行稀释并充分混匀;

5. 50 μL 稀释后样品待测。

、酶联免疫检测步骤

测定前须知:

1、使用之前将所有试剂和需用微孔板回升至室温。

2、使用之后立即将所有试剂放回2~8 ℃。

3、在使用中不要让微孔干燥。

4、在ELISA 分析中的重复性,很大程度上取决于洗板的一致性,正确的洗板操作是ELISA 测定程序中的要点。

5、在所有恒温孵育过程中,避免光线照射,用盖板膜盖住微孔板。


测定步骤:

1、将所需试剂和微孔板从冷藏环境中取出,在室温下平衡30 min,每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做2个平行试验。

2、加标准品:加标准品/样本50 L 到对应的微孔中,再加入酶标记物50 L/孔,然后再加入50 L/孔抗体工作液,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置室温避光反应30 min

3、洗板:小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,加洗涤液250μL/孔,每次浸泡15~30 s,充分洗涤4~5 次,用吸水纸拍干。

4、显色:加入底物液A 50 μL/孔,再加底物液B 50 μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25℃避光环境反应15 min

5、测定:每孔各加50 μL 终止液,设定酶标仪在450 nm 处,测定OD 值(建议用450/630 nm 双波长检测,在5 min内读完数据)。